Ταχεία εργαστηριακή διάγνωση των λοιμώξεων

Η ταχεία εργαστηριακή ανίχνευση λοιμογόνων παραγόντων συμβάλλει ουσιαστικά στην αντιμετώπιση των λοιμωδών νοσημάτων. Κατά την πορεία της εργαστηριακής διάγνωσης αναζητείται ο ίδιος ο παθογόνος μικροοργανισμός, ή αντιγόνο του ή το γενετικό του υλικό ή αντισώματα (στοιχείο της απάντησης του ξενιστή στο παθογόνο).

Γράφει ο
Νικόλαος Βακάλης 
Διευθυντής Κεντρικών Εργαστηρίων ΥΓΕΙΑ

Η ερμηνεία των αποτελεσμάτων απαιτεί – εκτός από την εξειδίκευση στο γνωστικό αντικείμενο – κατάρτιση στις τεχνικές παραμέτρους των δοκιμασιών, ενώ πάντοτε πρέπει να λαμβάνονται υπ’ όψιν άλλες σχετικές πληροφορίες και να αξιολογούνται σωστά, ιδίως σε περιπτώσεις που τα εργαστηριακά ευρήματα δεν φαίνεται να συμβαδίζουν με την κλινική εικόνα του ασθενούς.

Ο όρος «ταχεία» είναι σχετικός, εξαρτάται από το λοιμογόνο παράγοντα και μπορεί να ποικίλλει από ώρες έως και αρκετές ημέρες. Η προσέγγιση αφορά στον τομέα της κλινικής μικροβιολογίας (με το σύνολο των λοιμογόνων παραγόντων δηλαδή βακτήρια, μύκητες, ιούς, παράσιτα) και μειονεκτεί σε σχέση με τα ταχύτατα αποτελέσματα της αιματολογίας και βιοχημείας.

Οι διάφορες κατηγορίες δοκιμασιών ή εξειδικευμένες μέθοδοι μπορεί να ποικίλλουν μεταξύ εργαστηρίων ως προς την ευαισθησία τους, την ειδικότητα τους και τη θετική ή αρνητική προγνωστική τους αξία. Σε οποιαδήποτε εργαστηριακή προσέγγιση πολύ μεγάλη σημασία έχει ο τρόπος λήψης, μεταφοράς αλλά και χειρισμού του δείγματος από τους εργαστηριακούς.

Η άμεση μικροσκοπική εξέταση κλινικών δειγμάτων είναι μια πραγματικά ταχεία εργαστηριακή τεχνική η οποία μπορεί να λύσει δύσκολα διαγνωστικά προβλήματα. Αλλά ενίοτε δεν διακρίνεται για την ευαισθησία της ή την ειδικότητά της, εκτός εάν συνοδεύεται από άλλη μια εξειδικευμένη δοκιμασία, πχ ανίχνευση αντιγόνου.

Με την άμεση μικροσκοπική εξέταση δειγμάτων αίματος μπορεί να γίνει η ανίχνευση οξεάντοχων βακτηριδίων και λεπτόσπειρας στο αίμα (εικ. 1) ή ορισμένων αναεροβίων στα ούρα (εικ. 2) και η αναγνώριση διπλοκόκκων gram θετικών πχ πνευμονιοκόκκου ή gram αρνητικών πχ μηνιγγιτιδοκόκκου ή γονοκόκκου (εικ. 3). Μεγάλη είναι η συνδρομή της μικροσκόπησης στην ανεύρεση παρασίτων στο αίμα ή το μυελό των οστών (εικ. 4) και στα κόπρανα (εικ. 5 ) καθώς και μυκήτων σε διάφορα βιολογικά υγρά ή ιστούς (εικ. 6). Παρά τις προόδους που έχουν γίνει στη διάγνωση της ελονοσίας η μικροσκοπική εξέταση εξακολουθεί να είναι η μέθοδος αναφοράς (εικ. 7).

Η ταχεία ανίχνευση αντιγόνου, με ανοσοφθορισμό ή ανοσοχρωματογραφία, έχει βοηθήσει σημαντικά στη διάγνωση λοιμώξεων. Ήδη στη ρουτίνα χρησιμοποιείται η ανίχνευση αντιγόνου Legionella και Streptococcus pneumoniae στα ούρα, η ανίχνευση αντιγόνου αιμοφίλου της γρίππης, αναπνευστικού συγκυτιακού ιού και χλαμυδίων σε φαρυγγικό επίχρισμα, ενώ υπάρχει η δυνατότητα ανίχνευσης αντιγόνου πλασμωδίων στο αίμα και αντιγόνου παρασίτων (κρυπτοσπορίδιο – Giardia) στα κόπρανα.

Η ταχεία ανίχνευση κυκλοφορούντων αντιγόνων του τοιχώματος των μυκήτων προσφέρει σημαντική βοήθεια στη διάγνωση συστηματικών μυκητιάσεων. Τέτοια αντιγόνα είναι: α) Οι μαννάνες και αντι–μαννάνες που χρησιμοποιούνται για τη διάγνωση συστηματικών καντιντιάσεων. Θετική δοκιμασία μαννάνης συνήθως σχετίζεται με διήθηση ιστών από είδη Candida σε ασθενείς με συστηματική καντιντίαση. β) Οι Γαλακτομαννάνες βοηθούν στη διάγνωση ασθενών με διηθητική ασπεργίλλωση. Ανιχνεύονται στο ΕΝΥ, αίμα, ούρα, βρογχικές εκκρίσεις και περικαρδιακό υγρό. γ) Η ανίχνευση γλυκάνης βοηθάει στη διάγνωση μυκητιάσεων από Candida sp, Aspergillus, αλλά και ευκαιριακά παθογόνα, όπως Trichosporum sp, Fusarium sp,ή Histoplasma capsulatum. δ) Η γλυκουροξυλομαννάνη, που η ανίχνευσή της βοηθάει στην ταχεία αναγνώριση της κρυπτοκόκκωσης.

Η ανίχνευση τοξινών στα κόπρανα (C. difficile και shiga – like) προσφέρει επίσης σημαντική διαγνωστική βοήθεια.Οι παραπάνω δοκιμασίες και άλλες που βρίσκονται σε εξέλιξη χαρακτηρίζονται από υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία.

Η αναζήτηση αντισωμάτων χρησιμοποιείται για τη διάγνωση μιας οξείας ή χρόνιας νόσου. Η ευρεία χρήση της ανοσοενζυμικής δοκιμασίας δεν έχει καταργήσει τον ανοσοφθορισμό, τη σύνδεση συμπληρώματος και την έμμεση αιμοσυγκόληση (μέθοδοι που έχουν επικρατήσει στα κλινικά εργαστήρια). Η ανίχνευση IgM, IgA κατ’ αρχήν και IgG αντισωμάτων αργότερα, βοηθάει στον προσδιορισμό της πορείας της λοίμωξης.

Η αξιολόγηση της πορείας της νόσου απαιτεί ενίοτε τη λήψη δεύτερου δείγματος μετά από 10 – 14 ημέρες. Υπάρχουν διακυμάνσεις στη διατήρηση των IgM και IgA αντισωμάτων, αλλά και διασταυρούμενες αντιδράσεις ή ψευδώς θετικές IgM που δυσχεραίνουν τη διάγνωση (π.χ. στο τοξόπλασμα τα IgM αντισώματα μπορεί να παραμείνουν μέχρι και 18 μήνες). Σε περιπτώσεις που ο τίτλος των IgM προβληματίζει σε σχέση με τον προσδιορισμό της χρονικής στιγμής της λοίμωξης βοηθάει η απληστία (avidity) των IgG αντισωμάτων.

Η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδος Μοριακής Βιολογίας είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) (εικ. 8). Ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα με PCR μπορεί να οφείλονται σε ανεπαρκές δείγμα, ποσοτικά ή ποιοτικά. Ψευδώς θετικά δείγματα οφείλονται συνήθως σε επιμολύνσεις από άλλους μικροοργανισμούς. Πρόβλημα προς επίλυση είναι το θετικό αποτέλεσμα που οφείλεται σε παρουσία νεκρών μικροοργανισμών (μετά από θεραπεία) ή αποικισμό.

Οι δυνατότητες της διαγνωστικής αυτής προσέγγισης πολλαπλασιάζονται. Ήδη σε πολύ μικρότερο χρόνο από τον αντίστοιχο της καλλιέργειας, μπορεί να ανιχνευθούν (με real time PCR) μεμονωμένα βακτήρια ή ιοί ή ομάδα βακτηρίων – μυκήτων από διατιθέμενα στο εμπόριο αντιδραστήρια. Βέβαια, το κόστος αυξάνει και το αίτημα προϋποθέτει δυσχερές διαγνωστικό πρόβλημα. Και εδώ παρακολουθούμε την ευαισθησία και ειδικότητα τους στη ρουτίνα σε σύγκριση πάντοτε με τη συμβατική μεθοδολογία με την οποία υποχρεωτικά πρέπει να συγκρίνονται. Στον τομέα αυτόν ανοίγονται σημαντικές προοπτικές που σχετίζονται με τον προσδιορισμό αντοχής στα αντιβιοτικά και με επιδημιολογικές παραμέτρους. Η δυνατότητα ποσοτικοποίησης του προϊόντος ή των προϊόντων PCR είναι ένα πρόσθετο στοιχείο παρακολούθησης της ανταπόκρισης π.χ. σε αντιμυκητιασική αγωγή.

Βελτιώσεις και αυτοματισμοί έχουν γίνει και στις διαδικασίες των καλλιεργειών. Η καλλιέργεια, παρά την πρόοδο που έχει αναπτυχθεί σε άλλες δοκιμασίες, παραμένει σημείο αναφοράς και σύγκρισης όλων των λοιπών με αυτή. Βέβαια, όταν η καλλιέργεια παθογόνων μικροοργανισμών αποτελεί μονόδρομο, η επιλογή της ειδικής θεραπευτικής αγωγής καθυστερεί. Η προέλευση του κλινικού δείγματος, αν δηλαδή προέρχεται από θέση στείρα μικροβίων ή από αντίστοιχη με φυσιολογική χλωρίδα, καθορίζει και το χειρισμό του,γεγονός που έχει σχέση με την τελική έκβαση του αποτελέσματος.

Έτσι, σε κλινικά δείγματα από θέσεις που φυσιολογικά είναι στείρες μικροβίων (αίμα, ΕΝΥ και άλλα βιολογικά υγρά) μπορεί με κατάλληλα θρεπτικά υλικά να έχουμε ανάπτυξη πλείστων παθογόνων μικροβίων, βακτηρίων και κόκκων, μέσα σε 6 – 24 ώρες (εκτός ειδικών περιπτώσεων). Βέβαια, σε συνδυασμό με το αντιβιόγραμμα, το αποτέλεσμα σπάνια είναι έτοιμο πριν από την πάροδο 48 ωρών.

Η ερμηνεία των αποτελεσμάτων είναι συνήθως εύκολη, αλλά οι επιμόλυνση με βακτήρια της φυσιολογικής χλωρίδος του δέρματος είναι πιθανή. Η αξιολόγηση πρέπει να είναι προσεκτική, γιατί σε περιπτώσεις ανοσοκατασταλμένων ή ύπαρξης ενδοαγγειακών καθετήρων, αυτά τα ίδια βακτήρια μπορεί να ενοχοποιούνται ως παθογόνα.

Οι καλλιέργειες κλινικών δειγμάτων από θέσεις με φυσιολογική χλωρίδα (πχ από το αναπνευστικό ή κόπρανα) απαιτούν προσθήκη ειδικών εκλεκτικών θρεπτικών υλικών, κάτι που γίνεται στη ρουτίνα. Ειδικώτερα στα δείγματα από το αναπνευστικό απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή, γιατί πολλά από τα αίτια λοιμώξεων του ανώτερου αναπνευστικού (όπως πχ ο Πνευμονιόκοκκος, ο Αιμόφιλος και η Moraxella catarrhalis) είναι φυσιολογικοί ένοικοι της περιοχής. Άλλα βακτήρια (πχ Legionella, μυκοβακτηρίδια) και ιοί θέλουν ειδική λήψη και επεξεργασία.

Στην περίπτωση της καλλιέργειας κοπράνων πρέπει να υφίσταται η δυνατότης για αναγνώριση παθογόνων πέρα από τη γνωστή τριάδα (Σαλμονέλλα, Σιγκέλλα, Καμπυλοβακτηρίδιο), όπως vibrio ή Yersinia. Ειδικά παθογόνα των κοπράνων ενδεχομένως να χρειασθούν δοκιμασίες ανίχνευσης τοξινών, αντιγόνων ή Μοριακής Βιολογίας.

Σε γενικές γραμμές συχνά ένα σωστό τελικό αποτέλεσμα είναι η συνισταμένη της διενέργειας συνδυασμού εξετάσεων. Οι τεχνολογικές βελτιώσεις ουδόλως ελαχιστοποίησαν παληές συμβατικές εργαστηριακές προσεγγίσεις οι οποίες εξακολουθούν να έχουν περίοπτη θέση.

Εικόνα 1: Λεπτόσπειρα στο αίμα. Εύρημα (σπάνιο) κατά την πρώτη εβδομάδα μετά από την εκδήλωση της νόσου
(ακολούθως εξαφανίζεται από το αίμα και βρίσκεται τις επόμενες 10 ημέρες στα ούρα).

Εικόνα 2: Βacteroides sp. Αναερόβιο, η άμεση παρατήρηση του οποίου βοηθάει σε περιπτώσεις αποτυχίας της αναερόβιας καλλιέργειας.

Εικόνα 3: Γονόκοκκοι σε παρασκεύασμα ουρηθρικού εκκρίμματος. Η άμεση ανεύρεση ενδοκυττάριων gram αρνητικών διπλοκόκκων είναι διαγνωστικό στοιχείο.

Εικόνα 4: Λεισμάνια σε παρασκεύασμα από στερνική παρακέντηση . Η ανεύρεσή της θέτει τη σφραγίδα της διάγνωσης και εξακολουθεί να είναι μέθοδος αναφοράς.

Εικόνα 5: Κρυπτοσπορίδιο στα κόπρανα, με ανοσοφθορισμό. Είναι παράσιτο που πρέπει να ζητηθεί ειδικά. Πιο εύκολα μπορεί να αναζητηθεί το αντιγόνο του.

Εικόνα 6: Η ανεύρεση μυκήτων (εδώ Candida albicans) ειδικά σε ανοσοκατασταλμένους, κατευθύνει το θεράποντα ιατρό σε ανάλογη αντιμετώπιση.

Εικόνα 7: Πλασμώδια της ελονοσίας. Η έγκαιρη ανίχνευση παρασιταιμίας από Plasmodium falciparum (όπως εδώ) μπορεί να προστατεύσει τον ασθενή από επικίνδυνες επιπλοκές της νόσου.

Εικόνα 8: PCR για λεϊσμάνια. Κλασσική εργαστηριακή προσέγγιση που το προϊόν (εδώ 345 ζεύγη βάσεων) είναι αντιπροσωπευτικό της παρουσίας του παρασίτου.

Ιούλιος 2009