Προγεννητική διάγνωση χρωμοσωματικών ανωμαλιών του εμβρύου

Ο προγεννητικός έλεγχος είναι το σύνολο των εξετάσεων που πραγματοποιούνται πριν από τη γέννηση, με σκοπό να διαπιστωθούν πιθανές ανωμαλίες στο έμβρυο.

Γράφουν οι
Σταυρούλα Χριστοπούλου
Γεωργία Χριστοπούλου
Ζακλίν Ντόνοχιου
Μαργαρίτα Καρκαλέτση 
Ευαγγελία Μανίσαλη
Αναστασία Σπρινγκ
Θωμαΐς Τσεβά 
Βούλα Βελισσαρίου
Τμήμα Γενετικής και Μοριακής Βιολογίας ΜΗΤΕΡΑ
 

 Οι εξετάσεις προγεννητικού ελέγχου είναι οι μη επεμβατικές, όπως το υπερηχογράφημα, η μέτρηση της αυχενικής διαφάνειας, η μέτρηση βιοχημικών δεικτών στο αίμα της εγκύου, ή και οι επεμβατικές (λήψη χοριακών λαχνών, αμνιοπαρακέντηση, λήψη εμβρυϊκού αίματος). Με τα αποτελέσματα των μη επεμβατικών μεθόδων σε συνδυασμό με την ηλικία της μητέρας, μπορεί να εκτιμηθεί ο πιθανός κίνδυνος τον οποίο έχει το έμβρυο να πάσχει από κάποια χρωμοσωματική ανωμαλία. Η χρωμοσωματική σύσταση του εμβρύου όμως είναι δυνατόν να μελετηθεί και να υπάρξει ένα ασφαλές αποτέλεσμα μόνο με τις επεμβατικές μεθόδους.

Προγεννητικός καρυότυπος

Η προγεννητική διάγνωση ξεκίνησε το 1966, όταν οι Steel και Breg έδειξαν ότι η χρωμοσωματική σύσταση ενός εμβρύου είναι δυνατόν να προσδιοριστεί με ανάλυση του καρυότυπου των κυττάρων του αμνιακού του υγρού, τα οποία αναπτύσσονται σε καλλιέργεια. Το 1967 πραγματοποιήθηκε η πρώτη διάγνωση σε έμβρυο μετά από αμνιοπαρακέντηση. Ο καρυότυπος του εμβρύου αποτελεί μέχρι σήμερα πολύτιμο εργαλείο για τη διάγνωση των χρωμοσωματικών ανωμαλιών. Η συχνότερη αριθμητική χρωμοσωματική ανωμαλία είναι η τρισωμία 21, κλινική εκδήλωση της οποίας αποτελεί το σύνδρομο Down, με συχνότητα 1/800 γεννήσεις. Υψηλή συχνότητα συναντάται και στις αριθμητικές ανωμαλίες των χρωμοσωμάτων του φύλου. Οι συχνότητες των χρωμοσωματικών ανωμαλιών στα νεογέννητα αναγράφονται στον πίνακα 1.

Αναγκαία προϋπόθεση για το γενετικό έλεγχο του εμβρύου αποτελεί η λήψη εμβρυϊκών ιστών με επεμβατικές μεθόδους, όπως με λήψη χοριακών λαχνών – τροφοβλάστης (11η-14η εβδομάδα της κύησης), με λήψη αμνιακού υγρού (αμνιοπαρακέντηση, 16η-22η εβδομάδα) ή με λήψη εμβρυϊκού αίματος μετά την 20ή εβδομάδα της κύησης. Ο κίνδυνος αποβολής, τόσο για τη λήψη χοριακών λαχνών όσο και την αμνιοπαρακέντηση, κυμαίνεται από 0,5% έως 1,9%, ενώ η λήψη εμβρυϊκού αίματος ενέχει κίνδυνο αποβολής 3%-5%.

Με τις μεθόδους αυτές είναι δυνατόν να μελετηθούν τα χρωμοσώματα του εμβρύου, καθώς και να απομονωθεί DNA από τα εμβρυϊκά κύτταρα και να διαγνωστούν βλάβες σε συγκεκριμένα γονίδια που ευθύνονται για γνωστές γενετικές ασθένειες (μεσογειακή αναιμία, κυστική ίνωση, αχονδροπλασία κ.ά.).

Κύριες ενδείξεις προγεννητικής διάγνωσης

Η προγεννητική διάγνωση των χρωμοσωματικών ανωμαλιών του εμβρύου συνιστάται κυρίως στις κυήσεις με αυξημένο κίνδυνο, λόγω:
1. Προχωρημένης αναπαραγωγικής ηλικίας της μητέρας (άνω του 35ου έτους).
2. Ενδείξεων κατά τον βιοχημικό προγεννητικό έλεγχο 1ου και 2ου τριμήνου.
3. Υπερηχογραφικών ανωμαλιών του εμβρύου.
4. Χρωμοσωματικής αναδιάταξης σε έναν από τους γονείς.

Χρωμοσωματικές ανωμαλίες ανιχνεύσιμες με τον καρυότυπο και ταχεία προγεννητική διάγνωση
Με τον καρυότυπο ανιχνεύονται όλες οι αριθμητικές χρωμοσωματικές ανωμαλίες, καθώς και οι δομικές ανωμαλίες μεγέθους ?3-5Μb. Με τις τεχνικές σήμανσης και αναγνώρισης των χρωμοσωμάτων, το μέγεθος αυτό αντιστοιχεί περίπου σε μια ζώνη κατά μήκος ενός χρωμοσώματος (εικόνα 1). Για τη χρωμοσωματική κυτταρογενετική ανάλυση του εμβρύου με τον καρυότυπο απαιτείται η καλλιέργεια των εμβρυϊκών κυττάρων, η οποία απαιτεί συνήθως 10-15 ημέρες, γεγονός το οποίο παρατείνει την αγωνία των γονέων. Τα τελευταία έτη όμως έχουν αναπτυχθεί μέθοδοι οι οποίες επιτρέπουν την ταχεία διεξαγωγή ενός αποτελέσματος όσον αφορά στις συχνότερες αριθμητικές ανωμαλίες του εμβρύου.

Ταχεία Προγεννητική Διάγνωση

Η πλέον διαδεδομένη μέθοδος ταχείας προγεννητικής διάγνωσης είναι η ποσοτική φθορίζουσα αντίδραση της πολυμεράσης (QF-PCR: quantitative fluorescent polymerase chain reaction). Με τη μέθοδο αυτή εξάγεται ένα πρώτο αποτέλεσμα για την ανίχνευση των πιο συχνών ανευπλοειδιών, οι οποίες αφορούν στα χρωμοσώματα 13, 18, 21, Χ και Y. Το μεγάλο πλεονέκτημα της συγκεκριμένης μεθόδου είναι ότι δεν είναι απαραίτητη η καλλιέργεια των κυττάρων. Από μια μικρή ποσότητα χοριακών λαχνών, αμνιακού υγρού ή εμβρυϊκού αίματος, είναι δυνατόν να απομονωθεί αρκετό DNA για την εξαγωγή του αποτελέσματος σε λίγες ώρες.

Με τη μέθοδο αυτή, πολυμορφικές περιοχές (STRs-Short Tandem Repeats) ενισχύονται εκλεκτικά στα χρωμοσώματα 13, 18, 21, Χ και Υ, ανευπλοειδίες των οποίων ευθύνονται για τα συχνότερα σύνδρομα στις κυήσεις (σύνδρομα Down, Edwards, Patau, Klinefelter, Turner). Έπειτα από λήψη χοριακών λαχνών, αμνιακού υγρού ή εμβρυϊκού αίματος, απομονώνεται εμβρυϊκό DNA, ακολουθεί QF-PCR και τα προϊόντα της αντίδρασης διαχωρίζονται σε γενετικό αναλυτή. Η ανίχνευση προτύπου 3 αλληλομόρφων σε δύο τουλάχιστον δείκτες ενός χρωμοσώματος οδηγεί σε αποτέλεσμα συμβατό με την αντίστοιχη τρισωμία. Τα τρία αλληλόμορφα μπορεί να εμφανίζονται είτε ως τρεις κορυφές (τρισωμικό-τριαλληλικό πρότυπο) είτε ως δύο με ποσοτική σχέση 2:1 μεταξύ τους (τρισωμικό-διαλληλικό πρότυπο). Η ευαισθησία της μεθόδου είναι 99% για τα χρωμοσώματα τα οποία ελέγχονται.

Εκτός από την ανίχνευση των συχνότερων ανευπλοειδιών του εμβρύου, η παραπάνω μέθοδος μπορεί να ανιχνεύσει την παρουσία DNA, μητρικής συνήθως προέλευσης, στο υπό εξέταση δείγμα. Σημαντική είναι, επίσης, η δυνατότητα ταυτοποίησης διδύμων σε δίδυμες κυήσεις.

Καρυότυπος του εμβρύου

Ο χρωμοσωματικός έλεγχος του εμβρύου ολοκληρώνεται με τη μελέτη των χρωμοσωμάτων με τον καρυότυπο. Σε περίπτωση ευρήματος στον καρυότυπο, ενδέχεται να ζητηθεί κυτταρογενετικός έλεγχος των γονέων, προκειμένου να διαπιστωθεί αν το εύρημα είναι οικογενές ή de novo. Επίσης, σε ειδικές περιπτώσεις, μέθοδοι μοριακής κυτταρογενετικής, οι οποίες περιγράφονται παρακάτω, έρχονται να συμπληρώσουν τη συμβατική διάγνωση με τον καρυότυπο.
Αποτελέσματα του Tμήματος

Στο τμήμα Γενετικής και Μοριακής Βιολογίας του Νοσοκομείου ΜΗΤΕΡΑ, στα 13 περίπου χρόνια λειτουργίας του, έχουν πραγματοποιηθεί 27.345 προγεννητικές διαγνώσεις (7.676 διαγνώσεις σε δείγματα χοριακών λαχνών και 19.669 σε δείγματα αμνιακού υγρού). Στο σύνολο αυτό των δειγμάτων βρέθηκαν 683 δείγματα (ποσοστό 2,5%) με παθολογικό καρυότυπο (397 σε κυήσεις 1ου τριμήνου και 286 σε κυήσεις 2ου τριμήνου). Οι χρωμοσωματικές ανωμαλίες που παρατηρήθηκαν παρουσιάζονται στο γράφημα 1. Η μεγαλύτερη συχνότητα συναντάται στην τρισωμία 21. Ακολουθεί η τρισωμία 18 και κάποιες αριθμητικές ανωμαλίες των χρωμοσωμάτων του φύλου.

Χρωμοσωματικές ανωμαλίες μη ανιχνεύσιμες  με τον καρυότυπο

Όπως προαναφέρθηκε, η διακριτική ικανότητα του καρυότυπου κυμαίνεται μεταξύ 3-5Μb. Μικρότερες χρωμοσωματικές ανωμαλίες, όπως μικροδιπλασιασμοί και μικροελλείμματα, οι οποίες είναι δυνατόν να προκαλέσουν σοβαρά σύνδρομα, δεν ανιχνεύονται. Μοριακές μέθοδοι κυτταρογενετικής, όπως αυτές οι οποίες περιγράφονται στη συνέχεια, απαιτούνται για τη διάγνωση των υπομικροσκοπικών αυτών χρωμοσωματικών βλαβών.

FISH (Fluorescent In Situ Hybridization, φθορίζουσα υβριδοποίηση in situ): Η ανάπτυξη της μεθόδου έφερε μεγάλη πρόοδο στο χώρο της κυτταρογενετικής. Με τη FISH είναι δυνατόν να ανιχνευθούν στοχευμένα υπομικροσκοπικές χρωμοσωματικές ανωμαλίες που δε φαίνονται στον καρυότυπο, όπως είναι π.χ. το μικροέλλειμμα 22q11, το οποίο προκαλεί το σύνδρομο DiGeorge, με σοβαρές καρδιακές ανωμαλίες και συχνότητα 1/4.000 γεννήσεις (εικόνα 2).

ΜLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, πολλαπλή ενίσχυση ανιχνευτών εξαρτώμενη από την αντίδραση λιγάσης): Για τη διάγνωση των μικροελλειμμάτων/μικροδιπλασιασμών που δεν είναι δυνατόν να παρατηρηθούν με το συμβατικό καρυότυπο, εφαρμόζεται σήμερα με επιτυχία η μέθοδος MLPA. Η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται για τη διερεύνηση ενός μεγάλου αριθμού γνωστών συνδρόμων, τα οποία προκαλούνται από μικροελλείμματα ή/και μικροδιπλασιασμούς με συχνότητα 1/1.000 γεννήσεις, όπως DiGeorge, Williams, Prader-Willi κ.ά. (βλέπε σχετικό άρθρο στο παρόν τεύχος). Τα σύνδρομα αυτά συνδέονται με σοβαρές λειτουργικές ανωμαλίες και νοητική υστέρηση. Ταυτόχρονα με τα σύνδρομα αυτά ανιχνεύονται και υποτελομεριδιακές ανισοζυγίες όλων των χρωμοσωμάτων. Ο έλεγχος με MLPA συνιστάται σε περιπτώσεις όπου σε έμβρυα με φυσιολογικό καρυότυπο παρατηρούνται σοβαρά υπερηχογραφικά ευρήματα, όπως αυξημένη αυχενική διαφάνεια, καρδιακές ανωμαλίες, υπολειπομένη ανάπτυξη κ.ά.

Όλες οι παραπάνω μέθοδοι έχουν το μειονέκτημα ότι είναι σε θέση να ανιχνεύουν στοχευμένα τις συγκεκριμένες ανευπλοειδίες για τις οποίες έχουν σχεδιαστεί. Η νέα μέθοδος με την οποία ανιχνεύονται όλες οι χρωμοσωματικές ανωμαλίες σε ολόκληρο το γονιδίωμα είναι η τεχνική συγκριτικού γονιδιωματικού υβριδισμού με συστοιχίες (array CGH) ή πιο απλά ο μοριακός καρυότυπος.

Array CGH (array Comparative Genomic Hybridization, συγκριτικός γονιδιωματικός υβριδισμός με συστοιχίες) – Μοριακός καρυότυπος: Η εισαγωγή της νέας αυτής μεθόδου επιτρέπει την ανάλυση όλου του γονιδιώματος για την ανίχνευση χρωμοσωματικών ανωμαλιών. Εξαίρεση αποτελούν οι ισοζυγισμένες μεταθέσεις και αναστροφές, καθώς και οι πολυπλοειδίες, οι οποίες διαγιγνώσκονται μόνο με το συμβατικό καρυότυπο.

Η μέθοδος έχει αναπτυχθεί με διάφορες παραλλαγές. Βασική της αρχή αποτελεί η υβριδοποίηση DNA τόσο του εξεταζομένου όσο και του υγιούς ατόμου, σε ειδικά πλακίδια όπου έχουν καθηλωθεί DNA αλληλουχίες όλου του ανθρωπίνου γονιδιώματος. Τα DNA του εξεταζομένου δείγματος και του CφυσιολογικούE δείγματος αναφοράς, σημαίνονται με διαφορετικά φθοριοχρώματα. Ακολουθεί υβριδοποίηση στο πλακίδιο και στη συνέχεια συγκρίνεται η ένταση του φθορισμού των δύο δειγμάτων, προκειμένου να ανιχνευθούν οι ποσοτικές μεταβολές του γενετικού υλικού στις υπό εξέταση περιοχές. Η διακριτική ικανότητα της μεθόδου εξαρτάται από την πυκνότητα με την οποία αντιπροσωπεύεται το φυσιολογικό γονιδίωμα στις καθηλωμένες αλληλουχίες του DNA στο πλακίδιο (εικόνα 3). H μέθοδος, η οποία είναι ευρέως γνωστή και ως Cμοριακός καρυότυποςE, έχει αλλάξει δραστικά το τοπίο στη γενετική διάγνωση και επιτρέπει να αντληθούν πολύτιμες πληροφορίες για τη γενετική βλάβη σε επιλεγμένες περιπτώσεις υψηλού κινδύνου στο πλαίσιο του προγεννητικού ελέγχου (εικόνα 4).

Η αντικατάσταση του συμβατικού καρυότυπου με το μοριακό κατά την προγεννητική διάγνωση αποτελεί ακόμη θέμα συζήτησης στην επιστημονική κοινότητα, ενώ είναι ευρέως αποδεκτή για τη διερεύνηση μεταγεννητικά. Η μεγαλύτερη δυσκολία που υπάρχει αυτήν τη στιγμή, πέραν του κόστους, αφορά στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Υπάρχουν DNA αλληλουχίες διάσπαρτες στο ανθρώπινο γονιδίωμα, όπου ο αριθμός των επαναλήψεών τους διαφέρει από άτομο σε άτομο, χωρίς κλινικές επιπτώσεις στο φαινότυπο (CNVs, copy number variations). Έχουν αναφερθεί μεγάλες ελλείψεις ή διπλασιασμοί ακόμη και της τάξης των 10 Μb, χωρίς κλινικές επιπτώσεις. Επίσης, είναι δυνατόν η ίδια χρωμοσωματική ανωμαλία να μην προκαλεί κανένα πρόβλημα στο γονέα, αλλά να δημιουργήσει σοβαρά προβλήματα στο έμβρυο. Συνεπώς, πριν αρχίσει η εφαρμογή του μοριακού καρυότυπου στην προγεννητική διάγνωση σε επίπεδο ρουτίνας, θα πρέπει να υπάρχει η δυνατότητα να ερμηνευθούν τα αποτελέσματα και να συσχετιστούν με το φαινότυπο. Αυτό θα είναι εφικτό μόνο όταν θα έχουν καταγραφεί όλες οι χρωμοσωματικές ανωμαλίες και ο φαινότυπος o oποίος προκύπτει από αυτές και εμπλουτισθούν οι διεθνείς βάσεις δεδομένων.

Συμπέρασμα

Η προγεννητική διάγνωση αποτελεί έναν τομέα της γενετικής του ανθρώπου συνεχώς αναπτυσσόμενο, λόγω του εμπλουτισμού των γνώσεών μας και της ανάπτυξης νέων μεθοδολογιών. Ο συμβατικός καρυότυπος αναμένεται να αντικατασταθεί σε αρκετές περιπτώσεις από το μοριακό, όταν ξεπεραστούν οι δυσκολίες ερμηνείας των αποτελεσμάτων και μειωθεί το κόστος του. Επίσης, οι νέες μέθοδοι μη επεμβατικής προγεννητικής διάγνωσης είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν στο μέλλον για τη διάγνωση των συχνοτέρων αριθμητικών ανωμαλιών του εμβρύου στο αίμα της εγκύου (βλέπε σχετικό άρθρο στο παρόν τεύχος). Μέχρι τότε όμως, στην καθημερινή πράξη, ο συμβατικός προγεννητικός καρυότυπος, σε συνδυασμό με τις τεχνικές της μοριακής κυτταρογενετικής FISH, QF-PCR και MLPA, θα συνεχίσει να αποτελεί το πλέον απαραίτητο εργαλείο για τη διάγνωση των συχνοτέρων χρωμοσωματικών ανωμαλιών του εμβρύου.

Επιθυμούμε να ευχαριστήσουμε τις τεχνολόγους του Τμήματος, Αικατερίνη Μπατσούλη και Παγώνα Σκλαπάνη, καθώς και τη γραμματέα, Δήμητρα Λυμπεροπούλου, για την πολύτιμη βοήθεια στη διεκπεραίωση του έργου και στην ομαλή λειτουργία του Τμήματος.

Νοέμβριος 2012