Nested PCR για τον ιό της ηπατίτιδας Β

O ιός της ηπατίτιδας Β (HBV), που ενοχοποιείται για την οξεία και χρόνια ηπατίτιδα Β, ανήκει στην κατηγορία των hepadna DNA ιών. Ηδη το 1965 απομονώθηκε και ταυτοποιήθηκε το επιφανειακό του αντιγόνο (HbsAg ή αυστραλιανό αντιγόνο) και το 1970 ανακαλύφθηκε το πλήρες σωματίδιο του ιού.

Γράφουν οι
Μάρκος Μιχαλάτος
Βαγγέλης Χαροκόπος
Γεώργιος Νασιούλας Ph.D.
Μοριακοί Βιολόγοι

 Σήμερα είναι γνωστή η πλήρης νουκλεοτιδική αλληλουχία και γονιδιακή οργάνωση του γενετικού του υλικού¹.
Το γενετικό υλικό του ιού, μήκους περίπου 3200 νουκλεοτιδίων, που είναι DNA μερικώς δίκλωνο και μερικώς μονόκλωνο, περιέχει 4 ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης που κωδικοποιούν για τις πρωτεΐνες του ιού. Αυτές είναι η S του εξωτερικού καψιδίου, οι C και Ε του πυρηνικού καψιδίου, η P, που είναι η DNA πολυμεράση του ιού και η Χ της οποίας η λειτουργία δεν έχει πλήρως διαλευκανθεί ².
Δεδομένου ότι περισσότερο από το μισό του παγκοσμίου πληθυσμού έχει μολυνθεί σε κάποια φάση της ζωής του από τον HBV, ενώ τουλάχιστον το 5% πάσχει από χρόνια λοίμωξη, κατέστη αναγκαία η ανάπτυξη γρήγορων μεθόδων διάγνωσης του ιού και ελέγχου της λοίμωξης ³.
Αρχικά αναπτύχθηκαν μέθοδοι RIA για την ανίχνευση των αντιγόνων του ιού και μέθοδοι ELISA για την ανίχνευση των αντίστοιχων αντισωμάτων του ξενιστή. Νεότερες μέθοδοι προχώρησαν στην ανίχνευση του ιικού DNA με υβριδισμό. Η ανακάλυψη όμως της μεθόδου της αλυσωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) σε συνδυασμό με τη γνώση της πλήρους νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του ιού, ήταν καταλυτική στην ανίχνευση του HBV.

Τα πλεονεκτήματα της PCR ανίχνευσης του HBV είναι η ευαισθησία, ακόμη και σε πολύ χαμηλά επίπεδα ιαιμίας, η ειδικότητα, η αμεσότητα (εφόσον ανιχνεύει τον ίδιο τον ιό και όχι την ανοσολογική απάντηση του ξενιστή), καθώς και η εξάλειψη των ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων λόγω διασταυρούμενων αντιδράσεων ή λόγω εμβολιασμού.
Στο εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας του ΥΓΕΙΑ χρησιμοποιείται μια τροποποιημένη μέθοδος PCR, η λεγόμενη nested PCR ή διπλή ⁴. Ετσι αυξάνεται κατακόρυφα η ευαισθησία και η ειδικότητα της μεθόδου και γίνεται μια αρχική ποσοτική προσέγγιση του ιικού φορτίου του εξεταζομένου δείγματος. Η nested PCR είναι στην ουσία δύο διαδοχικές αντιδράσεις PCR, όπου η δεύτερη ενισχύει επιλεκτικά το προϊόν της πρώτης. Ετσι, χαμηλά ιικά φορτία, τα οποία είναι δυνατό να μη δώσουν θετικό σήμα στην ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της πρώτης PCR, ανιχνεύονται με τη δεύτερη. Στη συγκεκριμένη μέθοδο πολλαπλασιάζεται αρχικά μια περιοχή του γονιδίου, που κωδικοποιεί για την πρωτεΐνη επιφανείας HbsAg, μήκους 359 νουκλεοτιδίων και με τη δεύτερη αντίδραση μια εσωτερική περιοχή της πρώτης, μήκους 267 νουκλεοτιδίων. Τα δείγματα στα οποία συνήθως γίνεται η ανίχνευση είναι ορός ή πλάσμα αίματος.
Στην εικόνα 1 φαίνεται ο ηλεκτροφορητικός έλεγχος των προϊόντων, τόσο της πρώτης (Α) όσο και της δεύτερης (Β) αντίδρασης PCR, σε πήκτωμα αγαρόζης. Οπως φαίνεται, τα δείγματα 4 και 6 δίνουν θετικό σήμα και στην πρώτη και στη δεύτερη αντίδραση. Ομως τα δείγματα 3 και 5, που στην πρώτη αντίδραση δεν δίνουν θετικό σήμα, με τη δεύτερη PCR δίνουν, αποκαλύπτοντας την παρουσία HBV DNA και στα δείγματα αυτά. Σε γενικές γραμμές μπορούμε να πούμε ότι το ιικό φορτίο ήταν πιο χαμηλό από ότι στα υπόλοιπα δείγματα, εφόσον χρειάστηκαν δύο αντιδράσεις για την επιβεβαίωσή του.

Συμπερασματικά, η χρήση nested PCR βελτιώνει δραματικά την ευαισθησία της απλής αντίδρασης PCR και προσεγγίζει ικανοποιητικά τις έννοιες του χαμηλού και του υψηλού ιικού φορτίου, οι οποίες εκτός από τη διάγνωση είναι πολύ σημαντικές και για τον έλεγχο της θεραπευτικής αγωγής. Η ακριβής και έγκαιρη ανίχνευση του ιού hepadna μπορεί να αποβεί σωτήρια για τον ασθενή, ειδικά στην περίπτωση της κεραυνοβόλου ηπατίτιδας Β.
Στη μάχη για την εξάλειψη της ηπατίτιδας Β φαίνεται πως τα κύρια όπλα είναι δύο, ο εμβολιασμός και η έγκαιρη διάγνωση με ακριβείς και άμεσες μεθόδους όπως η nested PCR.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1. Kane M. Progress in the control of hepatitis B virus infection through immunization. Gut. 1993,34(2 Suppl):S10-2.
2. Χατζηγιάννης Σ., Sciff E.R. Συνοπτικές παρουσιάσεις – Ιογενής ηπατίτιδα: Η αντιμετώπιση της χρόνιας ηπατίτιδας Β. 1992
3. Chisari F V, Ferrari C. Hepatitis B Virus Immunopathogenesis. Annu Rev Immunol 1995, 13:29-60
4. Heermann K. et al. Quantitative Detection o Hepatitis B Virus DNA in Two International Reference Plasma Preparations. J Cl

Ιούνιος 2007