Διευρυμένος προγεννητικός έλεγχος χρωμοσωματικών ανωμαλιών του εμβρύου με τη μοριακή μέθοδο ανίχνευσης μικροελλειμμάτων και μικροδιπλασιασμών MLPA

Η εφαρμογή της μεθοδολογίας MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) έχει περιγραφεί και έχει εφαρμοστεί ευρέως, τόσο στην προγεννητική, όσο και στη μεταγεννητική γενετική διάγνωση.

Γράφουν οι
Γεωργία Χριστοπούλου
Θωμαΐς Τσεβά 
Αγγελική Χατζάκη 
Βούλα Βελισσαρίου
Τμήμα Γενετικής και Μοριακής Βιολογίας ΜΗΤΕΡΑ

 

Καθιστά δυνατή την ανίχνευση υπομικροσκοπικών ανωμαλιών των χρωμοσωμάτων του εμβρύου, όπως μικροελλείμματα και μικροδιπλασιασμούς, οι οποίες δε δύναται να διαπιστωθούν με το συμβατικό καρυότυπο. Τέτοιου είδους ανωμαλίες ευθύνονται για ορισμένα καλά χαρακτηρισμένα σύνδρομα μικροελλειμμάτων/μικροδιπλασιασμών, καθώς και για σημαντικό ποσοστό περιπτώσεων με μετρίου έως μεγάλου βαθμού ιδιοπαθή νοητική υστέρηση. Η εφαρμογή της μεθόδου MLPA έχει διευρύνει σημαντικά τη διαγνωσιμότητα χρωμοσωματικών ανωμαλιών κατά την προγεννητική διάγνωση.

Οι χρωμοσωματικές ανωμαλίες είναι τα συχνότερα γενετικά νοσήματα στον άνθρωπο και μία από τις βασικές αιτίες νοητικής υστέρησης, καθυστέρησης της ενδομήτριας και μεταγεννητικής ανάπτυξης, καθώς επίσης και ανωμαλιών του κρανιοπροσωπικού, σκελετικού, καρδιακού και ουρογεννητικού συστήματος. Η συχνότερη χρωμοσωματική ανωμαλία είναι η τρισωμία 21, κλινική εκδήλωση της οποίας είναι το σύνδρομο Down, με συχνότητα 1 στις 800 γεννήσεις. Ο καρυότυπος του εμβρύου που προκύπτει από την κυτταρογενετική ανάλυση αποτελεί μέχρι σήμερα το χρυσό κανόνα για τη διάγνωση των χρωμοσωματικών ανωμαλιών. Έχει όμως σοβαρούς περιορισμούς, κυρίως όσον αφορά στη διάγνωση υπομικροσκοπικών χρωμοσωματικών ανωμαλιών μεγέθους

Για τη διάγνωση των μικροελλειμμάτων/μικροδιπλασιασμών που δεν είναι δυνατόν να παρατηρηθούν με το συμβατικό καρυότυπο εφαρμόζεται σήμερα με επιτυχία μια μέθοδος της μοριακής βιολογίας η οποία είναι η πολλαπλή ενίσχυση ανιχνευτών εξαρτώμενη από την αντίδραση λιγάσης (MLPA: multiplex ligation-dependent probe amplification). Σε συνδυασμό με τη διεξαγωγή του συμβατικού καρυοτύπου, αποτελεί αυτό που ονομάζουμε σήμερα Cδιευρυμένο προγεννητικό έλεγχοE. Η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται για τη διερεύνηση μεγάλου αριθμού νοσημάτων των οποίων η αιτιολόγηση περιλαμβάνει μικροελλείμματα ή/και μικροδιπλασιασμούς. Τέτοια νοσήματα είναι σύνδρομα όπως τα DiGeorge, Williams, Prader-Willi κ.ά. Τα συχνότερα από αυτά αναγράφονται στον πίνακα 1.

Επίσης, με την ίδια μέθοδο εξετάζονται μικροελλείμματα/μικροδιπλασιασμοί των υποτελομεριδίων όλων των χρωμοσωμάτων. Οι περιοχές αυτές είναι πλούσιες σε γονίδια και έχει βρεθεί ότι ποσοτικές μεταβολές του γενετικού υλικού στις περιοχές αυτές ευθύνονται για το 5%-10% των πασχόντων, με μετρίου έως σοβαρού βαθμού ιδιοπαθή νοητική υστέρηση.

Η αρχή της μεθόδου βασίζεται στην υβριδοποίηση δυο ειδικών ανιχνευτών ανά περιοχή-στόχο, οι οποίοι συνδέονται μεταξύ τους με την αντίδραση της λιγάσης μόνον εφόσον οι ανιχνευτές είναι ειδικά υβριδοποιημένοι (εικόνα 1). Στη συνέχεια ακολουθεί αντίδραση PCR με εκκινητές συνδεδεμένους με φθοριόχρωμα και διαχωρισμός των προϊόντων της αντίδρασης σε γενετικό αναλυτή όπως και στη QF-PCR (Quantitative Fluorescence-PCR, ποσοτική φθορίζουσα PCR). Η σύγκριση της έντασης φθορισμού του υπό εξέταση δείγματος με φυσιολογικό πρότυπο οδηγεί στην ανίχνευση μικροελλείμματος ή μικροδιπλασιασμού. Εφόσον δεν υπάρχει στατιστικώς σημαντική μεταβολή, το δείγμα είναι φυσιολογικό, ενώ αν ευρίσκεται μεταβολή της τάξης του 35%-50% διαγιγνώσκεται αντιστοίχως η ποσοτική αλλαγή στο γενετικό υλικό.

Εφαρμογή της μεθόδου MLPA

Ο διευρυμένος προγεννητικός έλεγχος με MLPA συνιστάται κυρίως σε περιπτώσεις κατά τις οποίες στο έμβρυο παρατηρούνται σοβαρά υπερηχογραφικά ευρήματα, όπως καρδιακές ανωμαλίες, αυξημένη αυχενική διαφάνεια, υπολειπομένη ανάπτυξη κ.ά., ενώ ο καρυότυπος του εμβρύου είναι φυσιολογικός. Ωστόσο, λόγω της αύξησης της διαγνωστικής ικανότητας, όταν συνδυάζεται με τον καρυότυπο του εμβρύου, τείνει να προτείνεται σε όλες πλέον τις επεμβατικές προγεννητικές διαγνώσεις, ως Cδιευρυμένος προγεννητικός έλεγχοςE. Επίσης, η εφαρμογή της μεθόδου MLPA έχει αποτελέσει επιπλέον χρήσιμο εργαλείο για την τελική διάγνωση χρωμοσωματικών ανωμαλιών του εμβρύου σε περιπτώσεις όπου απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση σε ευρήματα στον καρυότυπο, ώστε να γίνει καλύτερη εκτίμηση της κλινικής τους σημασίας, όπως αποτυπώνεται και από την πείρα του εργαστηρίου μας.

Τα τελευταία πέντε χρόνια η μέθοδος εφαρμόζεται στο εργαστήριο Γενετικής του ΜΗΤΕΡΑ με επιτυχία, έχοντας διερευνήσει συνολικά περίπου 1.000 περιπτώσεις, η πλειονότητα των οποίων είναι αναλύσεις που αφορούν προγεννητικές διαγνώσεις (εικόνα 2). Ευρήματα ανιχνεύθηκαν σε 30/1.000 (3%) των περιπτώσεων και αφορούν μικροελλείμματα/μικροδιπλασιασμούς, τα οποία σχετίζονται με καλά χαρακτηρισμένα γενετικά σύνδρομα, χρωμοσωματικές ανωμαλίες και αναδιατάξεις ορατές στον καρυότυπο, και πολυμορφισμούς, κυρίως στις υποτελομεριδιακές περιοχές των χρωμοσωμάτων.

Στον πίνακα 2 φαίνονται μερικές από τις περιπτώσεις στις οποίες υπήρχαν κυτταρογενετικά ορατά ευρήματα και όπου η εφαρμογή του διευρυμένου προγεννητικού ελέγχου συνέβαλε ώστε να διερευνηθούν περαιτέρω, για να εκτιμηθεί στη συνέχεια η κλινική τους σημασία.

Σε ό,τι αφορά τα σύνδρομα μικροελλειμμάτων/μικροδιπλασιασμών, τα ευρήματα αφορούν κυρίως μεταγεννητικές περιπτώσεις με κλινική εικόνα χαρακτηριστική για σύνδρομα, όπως τα σύνδρομα DiGeorge και Williams (εικόνα 3α και 3γ). Στην προγεννητική διάγνωση, η εφαρμογή της μεθόδου αποκάλυψε ένα έμβρυο με μικροέλλειμμα στην περιοχή η οποία ευθύνεται για τα σύνδρομα Prader Willi/Angelman (εικόνα 3ε) και ένα έμβρυο με έλλειμμα στο βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 5, συμβατό με το σύνδρομο Cri-du-chat (σύνδρομο κλάματος γαλής, εικόνα 3δ).

Σημαντικό ποσοστό των ευρημάτων, ιδιαίτερα στις υποτελομεριδιακές περιοχές, αφορά κληρονομούμενους πολυμορφισμούς, οι οποίοι οφείλονται, είτε σε αληθή μικροελλείμματα/μικροδιπλασιασμούς χωρίς κλινική σημασία, είτε σε σημειακές μεταλλαγές σε περιοχές που επηρεάζουν τον υβριδισμό ή και τη σύνδεση των ανιχνευτών, οδηγώντας σε τεχνητή εμφάνιση εικόνας συμβατής με τα παραπάνω ευρήματα. Για τους λόγους αυτούς, όταν ανιχνεύονται ευρήματα είναι απαραίτητη η ανάλυση δειγμάτων DNA των γονέων, ώστε να διαπιστωθεί αν πρόκειται για γονεϊκής προέλευσης ή de novo εύρημα. Η διερεύνηση αυτή είναι απαραίτητη κυρίως σε ευρήματα τα οποία αφορούν στις υποτελομεριδιακές περιοχές. Στις περιπτώσεις όπου το εύρημα είναι de novo συνιστάται περαιτέρω διερεύνηση με άλλες μεθόδους. Στις περιπτώσεις κατά τις οποίες το εύρημα έχει κληρονομηθεί από υγιή γονέα, ο φαινότυπος του εμβρύου αναμένεται να είναι φυσιολογικός.

Υπάρχουν όμως περιπτώσεις στις οποίες είναι δυνατόν το ίδιο μικροέλλειμμα/μικροδιπλασιασμός να μην έχει καμία κλινική επίπτωση στο γονέα-φορέα, ενώ το έμβρυο να πάσχει. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι το σύνδρομο DiGeorge, στο οποίο άτομα με το ίδιο μέγεθος μικροελλείμματος είναι δυνατόν να εμφανίζουν σημαντική ετερογένεια στην εκδήλωση της κλινικής εικόνας του συνδρόμου, ή όταν το ακριβές μέγεθος του ελλείμματος δύναται να είναι διαφορετικό μεταξύ μελών της ίδιας οικογένειας. Πιθανή ερμηνεία για το γεγονός αυτό είναι ότι, εκτός από την παρουσία του μικροελλείμματος/μικροδιπλασιασμού, για να εκδηλωθεί το σύνδρομο το οποίο σχετίζεται με τη συγκεκριμένη γενετική περιοχή συμβάλλουν και άλλοι παράγοντες.

Συζήτηση και συμπεράσματα

Μέχρι σήμερα, ο συμβατικός καρυότυπος αποδεικνύεται μέθοδος επιλογής για τη διάγνωση των συχνοτέρων αριθμητικών και δομικών χρωμοσωματικών ανωμαλιών του εμβρύου. Οι γνωστοί όμως περιορισμοί σε ό,τι αφορά τη διακριτική ικανότητα, καθώς και το χρόνο απόδοσης των αποτελεσμάτων, κατέστησαν σταδιακά όλο και περισσότερο επιτακτική την ανάγκη εύρεσης και άλλων μεθόδων ώστε να υπάρχει η μέγιστη πληροφορία για τη χρωμοσωματική σύσταση του εμβρύου. Υπομικροσκοπικές μεταβολές του γενετικού υλικού είναι δυνατόν να οδηγήσουν στην εμφάνιση γενετικών συνδρόμων με βαρύτατη κλινική εικόνα, σε ό,τι αφορά τόσο τις σωματικές, όσο και τις νοητικές βλάβες. Η προγεννητική διάγνωση αυτών των συνδρόμων είναι δυνατόν, μετά από σωστή, διεξοδική πληροφόρηση και γενετική συμβουλευτική, να προλάβει τη γέννηση πασχόντων ατόμων, των οποίων το προσδόκιμο επιβίωσης είναι μειωμένο και η ποιότητα ζωής κακή. Ο διευρυμένος προγεννητικός έλεγχος συνιστάται κατά κύριο λόγο σε περιπτώσεις όπου κυτταρογενετικά ευρήματα χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης, ή σε περιπτώσεις όπου υπάρχουν υπερηχογραφικά ευρήματα κατά τη διάρκεια της κύησης και ο καρυότυπος του εμβρύου είναι φυσιολογικής μορφής. Ωστόσο, λόγω της υπολογίσιμης συχνότητας των συνδρόμων που ανιχνεύει και του γεγονότος ότι πολλές φορές πάσχοντα έμβρυα μπορεί να μην εμφανίσουν ενδείξεις στα διάφορα στάδια των προγεννητικών ελέγχων, η ευαισθητοποίηση των μελλοντικών γονέων σε συνεργασία με το θεράποντα ιατρό οδηγεί στην επιλογή του διευρυμένου προγεννητικού ελέγχου. Αν υπολογίσει κανείς τις συνέπειες της γέννησης ενός πάσχοντος παιδιού, ενώ η επιστήμη έχει στη διάθεσή της τον τρόπο να φθάσει σε έγκαιρη διάγνωση, υπογραμμίζεται η ανάγκη πληροφόρησης των υποψηφίων γονέων για τις διαγνωστικές δυνατότητες του διευρυμένου προγεννητικού ελέγχου και της ένταξής του στους ελέγχους ρουτίνας της προγεννητικής διάγνωσης χρωμοσωματικών ανωμαλιών του εμβρύου.

Νοέμβριος 2012